图 3 红景天黄酮与Mn2+以不同体积比配位光谱图变化

2.3.3温度因素的影响

由图4可知，红景天黄酮与Mn2+的配位反应随温度升高，其特征吸收峰最大吸收波长无明显波动。而其吸光度在室温(约17 ℃)时最大，当温度高于40 ℃时吸光强度下降，故其与Mn2+的配位反应温度不宜过高，以不超过40 ℃为优。

图 3 红景天黄酮与Mn2+配位光谱图随温度变化

2.4红景天黄酮与Mn2+配位反应稳定性结果分析

黄酮与Mn2+形成的配合物比较稳定，在2 h内吸光度减小了0.007，24 h后又减小了0.006，其配合物的生成速率与解离速率基本持平衡状态。但48 h后吸光度值急剧减小，可能是经过24 h后配合物的解离速率开始大于配位速率。

3 讨 论

红景天黄酮在室温下能与Mn2+在70%乙醇中发生配位反应，所生成的配合物较稳定且吸收强度较黄酮显著下降，这种改变可能引起红景天黄酮生物活性的变化。红景天黄酮与Mn2+的发生配位反应时溶液体系pH值应保持在5.0～9.0之间，此时配位反应进行的比较完全。在室温或低于40 ℃下有利于红景天黄酮与Mn2+配位反应的进行，高温不利于配合物的形成。在预先设定的不同配位比实验中，当红景天黄酮与Mn2+以1∶2配位时吸光度达最大值，可依此设计后续实验进行配位比的测定。关于此配位反应是否受其他因素如缓冲溶液体系、催化剂、黄酮含量等的干扰，以及红景天黄酮与不同的金属离子反应影响因素的结果，有待后续的深入研究。

本实验对于红景天黄酮与Mn2+配位影响因素的研究，可为来源不同的黄酮化合物与不同金属发生配位反应的动力学研究提供评价方法。此外，在不同的pH、温度及配位比的条件下，黄酮类化合物在体内与金属离子形成配合物，其药理活性会受到相应的影响。

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红景天是蔷薇目景天科红景天属多年生草本野生植物。目前有关红景天的应用研究较为广泛，尤其是对于其苷类、多糖类提取成分的药理活性。现有研究逐步表明，红景天黄酮类化合物相较于其他成分，在某些药理活性上占有一定的优势[1]。黄酮类化合物作为红景天中具有药理活性的主要化学活性成分，是有效的抗氧化剂和金属螯合剂，并具有抗氧化和抗疲劳、调节血脂血糖、防治心脑血管疾病、保护细胞及肝脏、抗菌、抗病毒等多种药理活性[1-2]。随着配位化学的不断发展，无机化学与有机化学之间建立了重要的桥梁，在药学领域逐渐散发出强大的潜力。近年来药物和化学的研究焦点锁定在了期望通过获得药物中活性成分的金属离子配合物以寻找高效、低毒的新型创新型药物。作为许多中草药的活性成分——黄酮类化合物自然成为了相关金属离子配合物的研究热点[3]。与黄酮配位的金属多集中在锌、铜、铝、锡、铬、锑等，尤其是人体所需的微量元素。人体所必需的微量金属元素如锌、铁、锰等，在细胞和生理过程中起关键作用，包括催化、调节和信号传导作用，与人体的新陈代谢相关。其中，微量元素Mn是人体内多种酶的重要组成成分，具有多种药理作用，参与糖原异生、酶的激活、抗氧化应激、增强细胞免疫功能等生理活动[4]。当黄酮类化合物与金属离子发生配位反应后，不仅能使二者原有的活性叠加，发挥药理作用，还可能产生原本不具备的新的药理活性。同时提高黄酮类配合物的稳定性和生物利用度[5-7]。本实验以红景天黄酮为黄酮化合物的代表，利用紫外分光光度法研究了溶液的pH、红景天黄酮与金属的配比、温度等因素对于红景天黄酮与金属Mn2+配位反应的光谱影响[8-10]。1 资料与方法1.1仪器与试剂样品来源：市售(北联药品总汇)。T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；RE3000旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；202-1AB型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；HH-601超级恒温水浴(金坛市华峰仪器有限公司)；FA1104N分析天平；索氏提取器。芦丁标准品(国药集团化学试剂有限公司，F)；乙醇(天津市永大化学试剂有限公司)；乙醚(天津市凯信化学工业有限公司)；石油醚(天津市大茂化学试剂厂)；硝酸铝(天津市大茂化学试剂厂)；亚硝酸钠(天津市大茂化学试剂厂)；盐酸(天津市凯信化学工业有限公司)；氢氧化钠(烟台市双双化工有限公司)；硫酸锰(中国化学试剂三厂天津)。以上试剂均为分析纯，实验用水为自制超纯撕炀疤熳芑仆崛〖按炕?1)总黄酮提取：样品粉碎过筛，烘干，用乙醚回流，乙醇提取、过滤、浓缩，即得到总黄酮提取液。用石油醚萃取，得到总黄酮沉淀并进行冷冻干燥，得红景天总黄酮粗提取物，备用。(2)红景天黄酮纯化：取红景天黄酮粗提取物用30%乙醇溶解稀释，备用。准确称取预处理后的D101湿树脂于100 mL具塞磨口三角瓶中，加入总黄酮溶液，在温度为30 ℃、转速为100 r/min条件下振荡5 h。取吸附饱和的树脂，精密加入体积分数为95%的乙醇40 mL，在30 ℃、转速为100 r/min振荡5 h，待其充分解吸后，收集解吸液浓缩并冷冻干燥，得纯化的红景天总黄酮。取经纯化的红景天黄酮约0.01 g，用30%乙醇稀释定容至100 mL，在200～400 nm波长范围内紫外扫描，确定最大吸收波红景天黄酮含量测定1.3.1绘制标准曲线取在105 ℃下干燥至恒重的芦丁标准品10 mg，加70%乙醇溶解定容至50 mL配成浓度为0.20 g/L的标准溶液。精确量取标准品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置于10 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；加10%的硝酸铝0.3 mL，摇匀，静置6 min；加4%氢氧化钠4.0 mL，用70%乙醇定容至10 mL。静置12 min,在510 nm下测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，芦丁浓度(g/L)为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程总黄酮含量测定取经纯化的总黄酮0.5g，加70%乙醇定容至100 mL作为黄酮试液。取黄酮试液0.5 mL于10 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；再加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min。最后加4%氢氧化钠溶液4.0 mL，用70%乙醇定容至10 mL，摇匀，静置12 min，在510 nm处测定吸光度，根据回归方程计算浓度及百分含量红景天黄酮与Mn2+配位反应光谱动力学研究1.4.1红景天黄酮及其金属配合物光谱学分析(1)黄酮化合物及金属离子溶液制备100 mg/L的黄酮化合物溶液的制备：取红景天总黄酮适量，用70%乙醇溶解定容，即得红景天黄酮溶液，备用。100 mg/L金属离子溶液制备：分别精密称取相当于金属离子10 mg的硫酸锰308 mg，用超纯水溶解并定容至100 mL容量瓶中，即得金属离子溶液。(2)黄酮化合物与Mn2+的光谱学研究分别精密移取黄酮化合物及Mn2+溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，黄酮溶液用70%乙醇定容，Mn2+溶液用超纯水定容。在200～600 nm下进行光谱扫描，记录光谱图，找出特征吸收峰对应的最大波长。精密移取黄酮化合物溶液2.5 mL于25 mL容量瓶中(取2份)，并分别加入足量的硫酸锰溶液(约10 mL)，用70%乙醇溶液定容，摇匀，室温下放置约2 h，在200～600 nm下扫描其紫外吸收光谱，分析图谱，并与单独没加Mn2+的黄酮化合物比较，确定是否发生配位反应。(以上均以70%乙醇溶液做空白对照)红景天黄酮与Mn2+配位反应影响因素实验(1)溶液pH的影响精密量取黄酮化合物溶液25 mL与硫酸锰溶液50 mL，置于250 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，摇匀；移取上述混合溶液9份(每份20 mL，含空白对照)，分别用0.1 mol/L盐酸，0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，另外两份分别加入适量盐酸和氢氧化钠使其pH<1.0和pH>12.0。全部溶液用70%乙醇定容至25 mL。室温下放置约2 h，在200～600 nm之间扫描其紫外吸收光谱，记录图谱及特征吸收峰的最大吸收波长。(空白对照，即平行条件下不调节pH，扫描紫外图谱)。(2)黄酮与金属不同配比的影响精密量取黄酮化合物溶液2.5 mL于25 mL容量瓶中(共取6份，含空白对照)依次加入硫酸锰溶液0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL，并用70%乙醇定容，使得黄酮化合物与Mn2+的摩尔比依次为1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5。置室温下反应约2 h，然后在200～600 nm之间扫描其紫外吸收光谱，记录图谱及特征吸收峰最大吸收波长。(3)温度的影响精密量取黄酮化合物溶液2.5 mL于25 mL容量瓶中(共取5份，含室温对照)，加入适量的硫酸锰溶液(约10.0 mL)，并用70%乙醇定容。分别控制其温度在0、20、40、60 ℃及室温下，反应约2 h，然后在200～600 nm之间扫描其紫外吸收光谱，记录图谱及特征吸收峰最大吸收波红景天黄酮与Mn2+配位反应稳定性实验取红景天黄酮溶液与Mn2+溶液按体积比1∶4加入25 mL容量瓶内，用70%乙醇定容，摇匀，室温放置2 h。以70%乙醇为空白，室温下在其特征吸收峰的最大吸收波长处测定吸光度值，每隔10 min测1次，在连续2 h内，记录其吸光度变化。2 h之后，每隔24 h，再连续测定2 d，记录其吸光度变化。若所得结果变化不大，则说明其配合物稳定性比较好。2 结果与分析2.1芦丁标准曲线分析曲线的回归方程为A=，R2=0.999 5。曲线相关系数良好，相关系数R=0.999 8，故可以根据此标准曲线对红景天黄酮的含量进行定量分析。通过计算得到红景天中黄酮化合物含量为1.32%红景天黄酮及其金属配合物光谱扫描结果比较分析红景天黄酮溶液光谱图与Mn2+配合物光谱图可知，黄酮化合物与Mn2+配合物溶液的吸收光谱特征吸收峰发生红移，并且其吸收强度也发生了变化，证明发生了配位反应。红景天黄酮与Mn2+配位后,其特征吸收峰从280 nm红移至326 nm，且吸光度明显降低(图1)。图 1 红景天黄酮与Mn2+配位前后紫外光谱图2.3红景天黄酮与Mn2+配位影响因素实验结果2.3.1pH因素的影响红景天总黄酮与Mn2+在不同pH下发生配位反应的紫外吸收光谱图变化情况见图2。由图2可知，红景天黄酮与Mn2+形成的配合物在pH<5.0时特征吸收峰的吸收强度减弱。pH>5.0后吸光度开始增大，在pH=9.0时达到最大，当pH再增大时其吸光度又逐渐减小。因此，推断红景天黄酮与Mn2+的发生配位反应时溶液体系pH值应保持在5.0～9.0之间，此时配位反应进行的比较完全。图 2 红景天黄酮与Mn2+配位在不同pH值下光谱图变化2.3.2不同配位比的影响红景天黄酮与Mn2+体积不同比例发生配位反应的紫外吸收光谱图见图3。由图3可知，当红景天黄酮与Mn2+以1∶1配位时，配合物在其特征吸收峰299 nm处吸光度为0.079。随Mn2+所占比例增大其吸收强度增大，在体积比为1∶2时吸光度达最大值0.081。之后随Mn2+增多，配合物的吸光度值稍有减小，但变化幅度不大。图 3 红景天黄酮与Mn2+以不同体积比配位光谱图变化2.3.3温度因素的影响由图4可知，红景天黄酮与Mn2+的配位反应随温度升高，其特征吸收峰最大吸收波长无明显波动。而其吸光度在室温(约17 ℃)时最大，当温度高于40 ℃时吸光强度下降，故其与Mn2+的配位反应温度不宜过高，以不超过40 ℃为优。图 3 红景天黄酮与Mn2+配位光谱图随温度变化2.4红景天黄酮与Mn2+配位反应稳定性结果分析黄酮与Mn2+形成的配合物比较稳定，在2 h内吸光度减小了0.007，24 h后又减小了0.006，其配合物的生成速率与解离速率基本持平衡状态。但48 h后吸光度值急剧减小，可能是经过24 h后配合物的解离速率开始大于配位速率。3 讨 论红景天黄酮在室温下能与Mn2+在70%乙醇中发生配位反应，所生成的配合物较稳定且吸收强度较黄酮显著下降，这种改变可能引起红景天黄酮生物活性的变化。红景天黄酮与Mn2+的发生配位反应时溶液体系pH值应保持在5.0～9.0之间，此时配位反应进行的比较完全。在室温或低于40 ℃下有利于红景天黄酮与Mn2+配位反应的进行，高温不利于配合物的形成。在预先设定的不同配位比实验中，当红景天黄酮与Mn2+以1∶2配位时吸光度达最大值，可依此设计后续实验进行配位比的测定。关于此配位反应是否受其他因素如缓冲溶液体系、催化剂、黄酮含量等的干扰，以及红景天黄酮与不同的金属离子反应影响因素的结果，有待后续的深入研究。本实验对于红景天黄酮与Mn2+配位影响因素的研究，可为来源不同的黄酮化合物与不同金属发生配位反应的动力学研究提供评价方法。此外，在不同的pH、温度及配位比的条件下，黄酮类化合物在体内与金属离子形成配合物，其药理活性会受到相应的影响。参考文献：[1] 万光,焦龙.红景天黄酮类化合物药理作用发展现状及相关专利分析[J].科技与创新,2019(3):25-29.[2] 冯媛媛,陈存.红景天黄酮类化合物及药理活性研究进展[J].中药材,2014,37(4):700-705.[3] 李海霞,郭芳.黄酮类化合物金属配合物研究进展[J].中国药房,2016,27(34):4872-4876.[4] 刘漩.微量元素锌、锰、铜的免疫作用[J].养殖与饲料,2017(9):38-39.[5] 张齐雄,施伦勇,刘衍季，等.黄酮类稀土金属配合物的研究进展[J].中国医药科学,2012,2(7)：44-46.[6] 钱俊臻,王伯初,谭君，等.黄酮类化合物的金属配合物及其药理作用[J].中国药理学通报,2012,28(8):1058-1062.[7] 马玲龙,李小爽,陆仲坤，等.芹菜素-铜(Ⅱ)配合物研制及其清除自由基活性[J].食品科技,2019,44(6):275-281.[8] 韩果萍,董社英,何志仙，等.柚皮素与过渡金属铜(Ⅱ)离子的配位反应[J].西安科技大学学报,2013,33(6):759-764.[9] 杨文,李海霞,陈丽珍，等.二氢杨梅素-镍配合物的合成及抗菌活性的研究[J].食品工业科技,2013,34(14):122-126.[10] 朱丽,马玲龙,李小爽，等.两种黄酮类铜(Ⅱ)配合物的制备及体外抗氧化活性[J].食品工业科技,2019,40(4):51-55.

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